خانه آموزش های رایگان چه زمانی کانال های کل شاخص تغییر می کند؟

چه زمانی کانال های کل شاخص تغییر می کند؟

2022-08-24

مکانیسم های مختلف اغلب در کاربردهای میکروسکوپ فلورسانس برای محدود کردن تحریک و تشخیص فلوروفورها به یک ناحیه نازک از نمونه استفاده می شود. از بین بردن فلورسانس پس زمینه از خارج از صفحه کانونی می تواند نسبت سیگنال به نویز را به طرز چشمگیری بهبود بخشد و در نتیجه ، وضوح مکانی ویژگی ها یا وقایع مورد علاقه باشد. میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کل (TIRFM) از خواص منحصر به فرد یک موج یا میدان ناشی از القا شده در یک منطقه نمونه محدود بلافاصله در مجاورت رابط بین دو رسانه که دارای شاخص های انکسار متفاوت هستند ، سوء استفاده می کند. در عمل ، متداول ترین رابط در استفاده از TIRFM ، منطقه تماس بین یک نمونه و یک پوشش شیشه ای یا ظرف کشت بافت است.

شکل 1 - کل فلورسانس بازتاب داخلی

مفاهیم اساسی TIRFM جدید نیستند ، و بیشتر علاقه های اخیر و اشتیاق به آن ، این تکنیک به دلیل پیشرفت های تکنولوژیکی که استفاده از آن را تسهیل می کند ، به وجود آمده است. در دسترس بودن سیستم های ابزار دقیق آماده برای استفاده از روش ، و همچنین تحولات فناوری فلوروفور ، مانند گونه های فلورسنت رمزگذاری شده ژنتیکی ، امکان بررسی تعدادی از غشای سلولی و سایر فرآیندهای سطح را به طور مستقیم امکان پذیر کرده است. روشی که قبلاً امکان پذیر نبود.

مبنای فیزیکی TIRFM

پدیده فیزیکی بازتاب داخلی کل (TIR) در برنامه های به ظاهر متنوع مانند انتقال داده های فیبر نوری مدرن ، و در استفاده از قرن های قدیمی توسط برش های الماس برای تقویت درخشش یا "آتش" از سنگهای قیمتی بریده شده به آن اعتماد شده است. در هر حالت ، شکست (یا خمش) نور به دلیل برخورد با رابط بین دو رسانه که دارای شاخص های انکسار متفاوت هستند (N) منجر به محصور کردن یک قسمت یا تمام نور به محیط با شاخص بالاتر می شود. یک پرتوی نوری جمع شده از طریق یک محیط و رسیدن به چنین رابط کاربری یا با ورود به محیط دوم ، یا بسته به زاویه حادثه و تفاوت در شاخص های انکسار دو رسانه ، یا در رابط منعکس می شود. بازتاب داخلی کل فقط در شرایطی امکان پذیر است که در آن نور تبلیغی با یک محیط با ضریب شکست پایین تر روبرو می شود. رفتار انکسار آن طبق قانون اسنل اداره می شود:

فرمول 1 - قانون اسنل

n (1) × sinθ (1) = n (2) × sinθ (2)

که در آن n(1) ضریب شکست بالاتر و n(2) ضریب شکست کمتر است. زاویه پرتو فرودی، با توجه به حالت عادی به سطح مشترک، با θ(1) نشان داده می شود، در حالی که زاویه پرتو شکست در محیط با شاخص پایین تر، با θ(2) نشان داده می شود. هنگامی که نور با زاویه کافی به سطح مشترک دو ماده برخورد می کند که به آن زاویه بحرانی می گویند (θ(c))، جهت شکست آن موازی با سطح مشترک می شود (90 درجه نسبت به حالت عادی)، و در زوایای بزرگتر منعکس می شود. به طور کامل به رسانه اول بازگشت.

شکل 2 - تنظیمات نورپردازی نمونه TIRFM

اگرچه نور وقتی در زوایای بزرگتر از زاویه بحرانی تابش می‌کند دیگر به محیط دوم نمی‌رود، نور بازتاب‌شده یک میدان الکترومغناطیسی بسیار محدود در مجاورت رابط، در محیط با شاخص پایین‌تر ایجاد می‌کند. این میدان ناپایدار از نظر فرکانس با نور فرودی یکسان است و از آنجایی که شدت آن با فاصله از سطح مشترک به طور تصاعدی کاهش می یابد، میدان حداکثر تا چند صد نانومتر به داخل نمونه در جهت z گسترش می یابد (طبیعی تا سطح مشترک). در یک مجموعه آزمایشی معمولی، فلوروفورهای واقع در مجاورت سطح مایع شیشه‌ای یا مایع پلاستیکی می‌توانند توسط میدان محو شونده تحریک شوند، مشروط بر اینکه دارای انتقال الکترونیکی بالقوه در انرژی‌های درون یا بسیار نزدیک به پهنای باند طول موج پرتو روشن‌کننده باشند. به دلیل سقوط نمایی شدت میدان فزاینده، تحریک فلوروفورها به ناحیه‌ای محدود می‌شود که معمولاً ضخامت آن کمتر از 100 نانومتر است. در مقایسه، این ضخامت بخش نوری تقریباً یک دهم ضخامت است که توسط تکنیک‌های میکروسکوپ فلورسانس کانفوکال ایجاد می‌شود. از آنجایی که از تحریک فلوروفورها در بخش عمده نمونه اجتناب می شود، و انتشار فلورسانس ثانویه را به یک ناحیه بسیار نازک محدود می کند، نسبت سیگنال به نویز بسیار بالاتری در مقایسه با روشنایی اپی فلورسانس میدان گسترده معمولی به دست می آید. این سطح سیگنال افزایش یافته تشخیص فلورسانس تک مولکولی را با روش TIRFM امکان پذیر می کند.

مفهوم اساسی کل فلورسانس بازتاب داخلی به طور شماتیک در شکل 1 نشان داده شده است، که در آن سلول های نمونه حاوی مولکول های فلورسنت (فلوروفورهای سبز در شکل) روی یک اسلاید میکروسکوپ شیشه ای پشتیبانی می شوند. ضریب شکست اسلاید شیشه ای (1. 518) و محیط نمونه آبی (تقریباً 1. 35) برای پشتیبانی از بازتاب داخلی کل در لام شیشه ای مناسب است. با تنظیم زاویه تابش تحریک لیزر به مقداری بیشتر از زاویه بحرانی، پرتو روشنایی پس از برخورد با سطح مشترک، به طور کامل به داخل اسلاید میکروسکوپ منعکس می‌شود و یک میدان ناپایدار در محیط نمونه بلافاصله در مجاورت رابط ایجاد می‌شود. فلوروفورهای نزدیک به سطح شیشه به طور انتخابی توسط برهمکنش با میدان فروپاشی برانگیخته می شوند و فلورسانس ثانویه از این ساطع کننده ها را می توان توسط اپتیک میکروسکوپ جمع آوری کرد.

همانطور که قبلاً بحث شد، زوایایی که توسط انتشار پرتوهای نور پس از شکست یا بازتاب در یک رابط بین رسانه‌های مختلف گرفته می‌شود، به زاویه تابش نور در سطح مشترک و ضریب شکست این دو ماده بستگی دارد. زاویه بحرانی وقوع، که فراتر از آن بازتاب داخلی کل رخ می دهد، می تواند با دستکاری عبارت قانون اسنل، که در بالا ارائه شده است، محاسبه شود. با اعمال معادله برای بررسی بیولوژیکی معمولی فرآیندهای غشای سلولی، ضریب شکست اسلاید میکروسکوپ یا لغزش پوششی با n (1) (تقریباً 1. 5) نشان داده می شود، در حالی که n (2) نشان دهنده ضریب شکست محلول بافر آبی یا سیتوپلاسمی است. اجزاء (1. 33 تا 1. 38). با n(1) بزرگتر از n(2)، زمانی که θ(1) از زاویه بحرانی θ(c) فراتر رود، بازتاب داخلی کل در محیط شیشه ای رخ می دهد. در زاویه برخورد بحرانی، شکست در 90 درجه رخ می دهد (sin θ(2) = 1)، و قانون اسنل به :

فرمول 2 - قانون اسنل

فرمول 3 - قانون اسنل

و بنابراین، زاویه بحرانی را می توان به صورت زیر بیان کرد:

فرمول 4 - زاویه بحرانی

بازتاب داخلی کل به طور ناگهانی به عنوان یک پدیده جدید در زاویه بحرانی رخ نمی دهد ، اما انتقال مداوم از انکسار غالب با مقدار کمی از بازتاب ، به بازتاب کل هنگامی که از زاویه بحرانی فراتر رود ، دنبال می شود. با افزایش زاویه حادثه به سمت مقدار زاویه بحرانی ، پرتو منتقل شده (انکسار) از شدت کم می شود در حالی که پرتو منعکس شده قوی تر می شود. در تمام زوایای بیشتر از زاویه بحرانی ، بازتاب داخلی کل حاصل می شود ، که در آن اساساً تمام نور به محیط اول بازتاب می یابد. حتی اگر نور دیگر به محیط دوم پخش نشود ، مقدار کمی نفوذ نور منعکس شده در رابط وجود دارد ، که سپس به موازات سطح پخش می شود و یک میدان الکترومغناطیسی در محیط دوم بلافاصله در مجاورت رابط ایجاد می کند. این زمینه به عنوان میدان evanescent نامیده می شود و در یک منطقه محدود در نزدیکی رابط ، قادر به فلوروفورهای هیجان انگیز است. دامنه ای که براساس آن ممکن است تحریک با پوسیدگی نمایی انرژی موج موج در جهت Z (عمود بر رابط) محدود شود. معادله زیر این انرژی را به عنوان تابعی از فاصله از رابط تعریف می کند:

فرمول 5 - انرژی به عنوان تابعی از فاصله از رابط

جایی که E (Z) انرژی در فاصله عمود z از رابط است و E (0) انرژی در رابط است. عمق نفوذ (D) به طول موج روشنایی حادثه (λ (i)) ، زاویه بروز و شاخص های انکسار رسانه در رابط ، مطابق معادله بستگی دارد:

فرمول 6 - عمق نفوذ

d = λ (i)/4π × (n (1) 2 sin 2 θ (1) - n (2) 2) -1/2

در زاویه های شیوع کوچک ، امواج نوری که از طریق رابط به محیط شاخص بازتابی پایین پخش می شوند سینوسی هستند و یک دوره مشخص دارند. با افزایش زاویه ، نزدیک شدن به مقدار بحرانی ، دوره پرتوهای انکسار طولانی تر می شود و جهت انتشار تقریباً به موازات رابط می شود. هنگامی که زاویه بحرانی به دست می آید ، دوره موج بی نهایت می شود و موجهای نوری انکسار عمود بر سطح سطحی تراز می شوند.

شکل 3 - TIRFM هدف دیافراگم عددی بالا

به طور خلاصه، چندین عامل حیاتی بر استفاده از موج ناپایدار در میکروسکوپ حاکم است. برای اینکه انعکاس درونی کل رخ دهد و یک میدان ناپایدار ایجاد کند، ضریب شکست محیط بروز روشنایی باید بیشتر از محیط نمونه (n(1) بزرگتر از n(2)) و زاویه تابش (θ) باشد.(1) ) باید بزرگتر از زاویه بحرانی باشد (θ(c)). طول موج نور تابشی هم بر عمق نفوذ موج فرورونده و هم بر فلوروفورهای خاصی که برانگیخته می‌شوند، تأثیر می‌گذارد، که باید دارای ویژگی‌های جذب مناسب در باند طول موج روشن‌کننده باشند. پیامد اثرات طول موج همراه با این واقعیت که انرژی موج فزاینده به صورت تصاعدی در جهت z کاهش می‌یابد، این است که تحریک فلورسنت بسیار خاص می‌تواند در یک بخش نوری بسیار نازک، معمولاً کمتر از 100 نانومتر در ضخامت القا شود. اگرچه TIRFM محدود به تصویربرداری در رابط دو رسانه مختلف با ضریب انکسار مناسب است، تعداد زیادی از برنامه ها به طور ایده آل برای این تکنیک مناسب هستند. یکی از فعال‌ترین حوزه‌های مورد علاقه تحقیقاتی در عرصه زیست‌پزشکی است که در آن بسیاری از سؤالات قانع‌کننده شامل فرآیندهایی است که در سطح سلول یا غشای پلاسمایی رخ می‌دهد - رابط‌های مناسب برای بررسی TIRFM.

رویکردهای ابزاری اساسی به TIRFM

دو روش اساسی برای پیکربندی یک ابزار برای میکروسکوپ فلورسانس بازتاب داخلی کلی وجود دارد: روش منشوری و روش عدسی شیئی. شکل 2 این دو پیکربندی کلی را نشان می دهد. در تکنیک منشور، یک پرتو لیزر متمرکز با استفاده از یک منشور متصل به سطح آن به لغز پوششی میکروسکوپ وارد می‌شود و زاویه برخورد پرتو با زاویه بحرانی تنظیم می‌شود (شکل 2(a) را ببینید). تکیه بر یک منشور برای معرفی پرتو روشنایی دارای چندین محدودیت است، در درجه اول به دلیل محدودیت های هندسی در دستکاری نمونه، و اگرچه این روش برای بیش از دو دهه در کاربردهای بیولوژیکی مورد استفاده قرار گرفته است، هرگز به یک ابزار تحقیقاتی اصلی تبدیل نشده است. تغییرات زیادی در پیکربندی منشور وجود دارد، اما اکثر آنها دسترسی به نمونه را محدود می‌کنند و انجام دستکاری‌ها، تزریق رسانه به فضای نمونه یا انجام اندازه‌گیری‌های فیزیولوژیکی را دشوار می‌کنند.

یکی دیگر از مضرات تکنیک منشور این است که در بیشتر تنظیمات مبتنی بر طرح های میکروسکوپ معکوس ، مانند Nikon Eclipse Ti2 ، این روشنایی در قسمت نمونه مقابل اپتیک هدف قرار می گیرد ، و نیاز به تصویربرداری از منطقه میدان تبخیر از طریق بخش عمده نمونه از نمونه ها دارد. وادقرار دادن منشور در قسمت عینی نمونه برای جلوگیری از این امر به دلیل نزدیکی یک هدف از مسافت کوتاه مدت به محل نمونه و منشور ، مشکلات اضافی را نشان می دهد. پیچیدگی و دقت کلی مورد نیاز در پیکربندی یک سیستم تصویربرداری برای استفاده از کل بازتاب داخلی ، بسیاری از محققان بالقوه را قبل از اینکه سیستم های کامل ("کلید در دست") از تولید کنندگان میکروسکوپ در دسترس باشد ، دلسرد می کند. محققانی که می خواستند از این تکنیک استفاده کنند ، برای مهندسی و ساخت سیستم های خود لازم بودند و این مشکل ، همراه با ضرورت تنظیم و نگهداری لیزر باز روی یک نیمکت نوری ، به این معنی بود که کاربران قبلی روش منشور بیشتر فیزیکدانان بودنداز زیست شناسان.

شکل 4 - میکروسفرها در فلورسانس TIR و گسترده

تکنیک لنز عینی ، که گاهی اوقات از طریق روشنایی لنز به آن گفته می شود ، از بسیاری از محدودیت های استفاده از منشور برای معرفی نور در زاویه های مورد نیاز جلوگیری می کند (شکل 2 (ب) را ببینید). در این روش ، از این هدف برای معرفی لیزر منسجم یا نورپردازی لامپ قوس غیر انسجام به رابط Coverslip-specimen استفاده می شود. زاویه های بروز بیشتر از زاویه بحرانی با استفاده از اهداف دیافراگم عددی بالا (در حالت ایده آل 1. 45 یا بالاتر) حاصل می شود. به طور معمول دیافراگم عددی یک هدف به عنوان توصیف توانایی جمع آوری نور لنز تصور می شود. برعکس ، دیافراگم عددی به طور مستقیم دامنه زاویه هایی را تعیین می کند که در آن نور می تواند از هدف در هنگام استفاده از آن برای ارائه روشنایی استفاده کند. رابطه بین دیافراگم عددی و زاویه بروز روشنایی قابل دستیابی توسط معادله زیر شرح داده شده است:

فرمول 7 - دیافراگم عددی

دیافراگم عددی (NA) = N × SIN (θ)

که در آن NA دیافراگم عددی هدف است، n نشان دهنده ضریب شکست است و θ نصف دیافراگم زاویه ای هدف است. ترکیب این رابطه با شرایط بازتاب داخلی کل که در بالا داده شد نشان می‌دهد که سلول‌های زنده با ضریب شکست معمولی 1. 38 برای دستیابی به انعکاس کلی داخلی، نیاز به روشنایی با شیئی با دیافراگم عددی بیشتر از 1. 38 دارند. نور وارد شده به هدف باید از قسمتی از مخروط دیافراگم مربوط به مقادیر عددی دیافراگم بزرگتر از 1. 38 عبور کند تا کاملاً در سطح مشترک نمونه-شیشه منعکس شود. اگر از نور لیزر منسجم استفاده شود، باید در حاشیه دیافراگم عقب هدف متمرکز شود تا اطمینان حاصل شود که نور از سطح نوری جلو با زاویه ای برابر یا بیشتر از مقدار بحرانی خارج می شود. در مورد روشنایی غیر منسجم، مانند لامپ تخلیه قوس الکتریکی، یک ماسک به شکل یک دیسک مات باید به مسیر نوری وارد شود تا نور عبوری از هدف را به ناحیه بیرونی دیافراگم عقب محدود کند..

با محدود کردن نور در صفحه کانونی عقب هدف به یک ناحیه حلقوی دایره ای، پرتوهای نور از مرکز مخروط روشنایی که معمولاً در زوایای زیر بحرانی ظاهر می شوند مسدود می شوند. انتشار حاصل از هدف، یک مخروط توخالی از نور است که با نیم زاویه کافی برای ایجاد انعکاس داخلی کامل به سطح مشترک TIR برخورد می کند. اگر روشنایی قابل توجهی از بخش مرکزی دیافراگم عقب هدف (ناحیه دیافراگم عددی پایین) عبور کند، به جای بازتاب کلی داخلی، نور اپی ایجاد می شود و نسبت سیگنال به نویز در صفحه تصویر را کاهش می دهد. در عمل، دیسک مسدود کننده نور مات را می توان بر روی یک نوار لغزنده متحرک نصب کرد، که سوئیچ سریع بین حالت های تصویربرداری TIRF و epi-new را تسهیل می کند.

انجام تحریک میدان evanescent با استفاده از اهداف با شرور بالا ، انعطاف پذیری بیشتری را در گزینه های دستکاری و اندازه گیری نمونه نسبت به تکنیک مبتنی بر منشور فراهم می کند ، اما کنترل دقیق زاویه روشنایی حادثه دشوارتر است. هنگامی که از منبع لیزر استفاده می شود ، زاویه بروز نور همراه با منشور می تواند به راحتی در طیف وسیعی متفاوت باشد و امکان کنترل ساده عمق نفوذ میدان فرسوده را فراهم می آورد. با استفاده از سیستم عینی ، نقطه تمرکز لیزر در هواپیمای کانونی عقب هدف خارج از محور است (استفاده از قسمت بیرونی دیافراگم) و افزایش فاصله شعاعی از محور لنز باعث افزایش متناظر در زاویه ای می شود که در آننور روی نمونه حادثه است (شکل 3 را ببینید).

اگر دیافراگم عددی هدف کافی باشد ، می توان زاویه بحرانی برای بازتاب داخلی کل را بدست آورد. از آنجا که مؤلفه سلولی اولیه (سیتوزول) دارای ضریب شکست تقریباً 1. 38 است ، یک دیافراگم عددی عینی که بیش از این مقدار مورد نیاز است. با یک هدف دیافراگم عددی 1. 4 ، تنها چند درصد از ناحیه محیطی لنز را می توان برای بازتاب کل داخلی مورد استفاده قرار داد و زاویه بحرانی فقط می تواند از حاشیه فراتر رود و اتصال لیزر به دیافراگم عقب رویه ای بسیار چالش برانگیز است. بدیهی است که اهداف دیافراگم عددی بالاتر سودمند است و حاشیه کار اضافی را برای تنظیم دقیق زاویه های بیش از زاویه بحرانی فراهم می کند. پس از فراتر رفتن از زاویه بحرانی ، افزایش بیشتر در فاصله شعاعی نقطه کانونی لیزر از محور لنز برای کاهش عمق نفوذ میدان فرسوده به روشی صاف و قابل تکرار خدمت می کند.

برنامه های TIRFM

به طور کلی ، روشنایی بازتاب داخلی کل دارای مزایای بالقوه در هر کاربردی است که نیاز به تصویربرداری از ساختارهای دقیقه یا مولکول های منفرد در نمونه هایی دارد که تعداد زیادی از فلوروفورها در خارج از صفحه نوری مورد علاقه واقع شده اند ، مانند مولکول ها در محلول در حرکت براون ، وزیکول های تحت اندوسیتوز یا اندوسیتوز یا اندوسیتوز یااگزوسیتوز یا قاچاق پروتئین منفرد در سلول ها. چنین نمونه هایی به طور معمول افزایش چشمگیر نسبت سیگنال به نویز از محدودیت ضخامت منطقه تحریک را نشان می دهند. شکل 4 تصاویر به دست آمده از محلول میکروسفرهای فلورسنت را با استفاده از روش TIRFM (شکل 4 (b)) و روشنایی اپی فلورسانس معمولی ارائه می دهد (شکل 4 (D)). در سمت چپ هر تصویر هیستوگرام شدت مربوط به آن (شکل 4 (a) و 4 (c)) است. وضوح بهبود یافته کره با افزایش نسبت سیگنال به نویز (S/N) از 1. 3 به 35 در تصاویر مشهود است ، و در محلی سازی تیز و شدت سیگنال بالاتر در هیستوگرام مربوط به تصویر TIRFM (شکل4 (الف)).

شکل 5 - چسبندگی کانونی سلول در فلورسانس گسترده و TIR

مدتهاست که به رسمیت شناخته شده است که TIRFM به طور بالقوه می تواند به ابزاری قدرتمند در پاسخ به تعدادی از سؤالات بیولوژیکی تبدیل شود و اگرچه بیش از 20 سال از آن استفاده می شود ، این تکنیک تا همین اواخر توجه قابل توجهی را به خود جلب نکرده است. تماس های سلولی فیبروبلاستهای پوستی انسان ، برچسب زده شده با لیپیدهای فلورسنت ، در اوایل دهه 1980 توسط TIRFM مورد بررسی قرار گرفت. یک مطالعه دیگر که تقریباً در همان زمان انجام شده است ، از TIRFM در ترکیب با بازیابی فوتوبلیاژ فلورسانس (FRAP) برای روشن شدن دینامیک سطح زیست مولکولی استفاده شده است ، در حالی که هنوز دیگر روی انتقال انرژی در آلبومین سرم گاو محدود به سطوح متمرکز شده است. مطالعه دوم TIRFM را با انتقال انرژی رزونانس فلورسانس (FRET) ترکیب کرد ، تکنیکی دیگر که در حال حاضر رشد سریع کاربرد را تجربه می کند.

بیشتر گرایش به سمت استفاده بیشتر از TIRFM، تحریک عکس، و سایر تکنیک های پیشرفته به دلیل افزایش دسترسی به ابزار دقیق مدولار پیشرفته است که مهندسی و ساخت سیستم های سفارشی برای هر برنامه تحقیقاتی خاص را غیر ضروری می کند. عامل مهم دیگر توسعه ابزارهای بیولوژیکی همه کاره است که می تواند برای طیف گسترده ای از مشکلات به کار رود، که مهمترین آنها احتمالاً استفاده از پروتئین فلورسنت سبز (GFP) و مشتقات فیروزه ای، آبی، زرد و قرمز آن است. GFP، مشتق شده از چتر دریایی، برای بیان و نمایش فلورسانس نیازی به کوفاکتورهای خاص گونه ندارد و می تواند به صورت تجربی در بین گونه ها استفاده شود. فلوروفور بیولوژیکی از طریق نوترکیبی ژنتیکی در صدها پروتئین وارد شده است و اساساً در این پتانسیل نامحدود است. یکی دیگر از قابلیت‌های امیدوارکننده ناشی از توسعه جهش‌یافته‌های GFP است که به عنوان شاخص کلسیم درون سلولی در فرآیند آزادسازی انتقال‌دهنده عصبی عمل می‌کنند. این پروتئین ها در برخی مطالعات از طریق انتقال انرژی رزونانس فلورسانس پایش شده اند.

TIRFM ابزاری ایده‌آل برای بررسی مکانیسم‌ها و پویایی بسیاری از پروتئین‌های درگیر در تعاملات سلولی است. شکل 5 تصاویر مقایسه ای از سلول های زنده (سلول های اپیتلیال کلیه کانگورو PtK1 که GFP-vinculin را بیان می کنند) را با استفاده از روش مرسوم اپی فلورسانس میدان گسترده (شکل 5(a)) و روشنایی موج ناپایدار (شکل 5(b)) نشان می دهد. تصویر TIRFM محلی‌سازی پروتئین همجوشی را در چسبندگی‌های کانونی سلولی در سطح مشترک سوبسترا در تضاد چشمگیر با تاری ایجاد شده توسط فلورسانس خارج از صفحه در تصویر epi-illumination نشان می‌دهد. تصویربرداری سلول زنده یکی از امیدوارکننده ترین کاربردهای تکنیک TIRFM را نشان می دهد. فعل و انفعالات پروتئین در سطح غشای سلولی، مانند آنهایی که در چسبندگی کانونی دخیل هستند، اهمیت فوق العاده ای در زیست شناسی سلولی دارند. درک سیگنال‌های دخیل در رشد طبیعی سلول و تضعیف آن ناشی از تماس‌های سلولی (ممانعت از تماس) ممکن است بینشی در مورد رشد غیرطبیعی سلولی که در بیماری‌هایی مانند سرطان رخ می‌دهد، ارائه دهد.

شکل 6 - توالی مرور زمان دینامیک پروتئین

در سطح زیست مولکولی، تکنیک‌های TIRFM برای تصویربرداری از مولکول‌های منفرد پروتئین جهش یافته GFP-Rac که در امتداد فیلوپودیای نازک سلول‌هایی که روی یک بستر رشد می‌کنند، استفاده شده است (شکل 6). این پروتئین در تحرک سلولی نقش دارد و آگاهی از پویایی تعاملات آن در غشای سلولی برای درک این فرآیند بسیار مهم است. تجسم فلورسانس تک مولکولی با وضوح زمانی کافی برای مطالعات دینامیکی با TIRFM امکان پذیر است، زیرا نسبت سیگنال به نویز فوق العاده ای که توسط تحریک موج ناپایدار ایجاد می شود. شکل 6 چهار فریم فاصله زمانی متوالی را نشان می‌دهد که در فواصل زمانی 200 میلی‌ثانیه گرفته شده‌اند و حرکت یک مولکول پروتئین همجوشی GFP-Rac (پیکان‌ها) را از میان یک فیلوپودیوم ظریف سلول Xenopus که روی یک بستر رشد می‌کند، نشان می‌دهد.

اگرچه TIRFM محدود به بررسی ساختارها و فرآیندهایی است که در یا نزدیک سطح مشترک لغزش-نمونه رخ می‌دهند، به طور همزمان اتفاقی است که بسیاری از سؤالات مورد علاقه فعلی در علوم بیولوژیکی و زیست‌پزشکی را می‌توان در غشای سلولی بررسی کرد. حوزه علوم اعصاب رشته ای است که در آن سؤالات اساسی متعددی می توانند با میکروسکوپ TIRF مورد مطالعه قرار گیرند. یک کاندید ایده آل برای کاربرد این تکنیک، مطالعه آزادسازی و جذب ناقل عصبی در سیناپس است. از لحاظ تاریخی، مکانیسم‌های قاچاق و همجوشی غشاء، از جمله آزادسازی (اگزوسیتوز) یا جذب (اندوسیتوز) وزیکول‌های سیناپسی، با استفاده از روش‌های ژنتیکی، بیوشیمیایی و میکروسکوپی الکترونی مورد بررسی قرار گرفته‌اند. این تکنیک‌ها از جهاتی غیرمستقیم هستند یا فقط نمایشی فوری از فرآیندهای در حال وقوع را ارائه می‌دهند و نمی‌توانند پویایی پیچیده فعالیت غشای سلولی را حل کنند.

توسعه تکنیک پیگیری وصله باعث شده است که اندازه گیری های خازن مورد استفاده قرار گیرد تا با تغییرات الکتریکی بسیار کوچک ، علاوه بر این یا تفریق سطح سطح غشای یا انتشار مواد اکسیداتیو ، نشان دهد. کمبود این تکنیک این است که فقط حوادث فیوژن شناسایی می شوند و در حالی که می توان وضوح زمانی بالایی حاصل شد ، اطلاعات بسیار کمی در مورد موقعیت مکانی وقایع مهم وجود دارد. از آنجا که همه وقایع در کنار هم تشخیص داده می شوند ، هیچ ویژگی به دست نمی آید و جزئیات سایر مراحل قاچاق وزیکول ، اتصال و فیوژن غشایی به طور معمول از اندازه گیری های سلولی همراه با مدل سازی جنبشی استنباط می شود. اگرچه تحقیقات توسط میکروسکوپ الکترونی وضوح مکانی استثنایی را ارائه می دهد ، مطالعات سلول زنده یا پویا امکان پذیر نیست و همبستگی دیدگاه های آنی با سایر اندازه گیری ها بسیار دشوار است. استحکام روش TIRFM ، که در تحقیقات اخیر نشان داده شده است ، این است که مشاهده مستقیم بصری از فعل و انفعالات پویا پروتئین-وستول امکان پذیر است.

شکل 7 - تعامل پروتئی ن-ویکول مورد بررسی توسط میکروسکوپ TIRF

TIRFM به دلیل توانایی حل وزیکول های فردی به صورت نوری ، و پیروی از پویایی تعامل آنها به طور مستقیم ، توانایی مطالعه تعداد زیادی از پروتئین های درگیر در فرآیندهای عصبی را به شکلی که قبلاً ممکن نبود ، فراهم می کند. یک مطالعه جدید نشان داد که انتشار عروق سیناپسی حاوی لیپیدهای فلورسنت از مناطق فعال و حمل و نقل بعدی وزیکول ها از یک استخر ذخیره واقع در 20 نانومتر از غشای پلاسما برای تأمین مجدد موارد آزاد شده است. یک مطالعه دیگر شامل تجسم مستقیم نقش اکتین در فرآیند پویا اندوسیتوز در سلولهای ماست کشت شده است. رشته های GFP-actin در اطراف وزیکولهای پینوسیتیک با برچسب فلورسانس مشاهده شده و آنها را در یک جریان اکتین به داخل سلول می کشند. یک توالی تصویربرداری TIRFM با گذشت زمان در شکل 7 ارائه شده است که پویایی GFP-actin را در طول اندوسیتوز نشان می دهد. شش فریم پی در پی فواصل زمانی مختلف را در طیف وسیعی از 0 تا 65 ثانیه نشان می دهد. فلش های سفید در هر قاب نشان دهنده سیگنال پروتئین فیوژن GFP-actin است.

تصویربرداری چند طیفی که تعامل وزیکول-اکتین در طول اندوسیتوز را نشان می دهد در شکل 8 ارائه شده است. در تصویر دو کانال (شکل 8 (a)) ، جریانی از GFP-actin با برچسب سبز در اطراف یک وزیکول حاوی تگزاس قرمز دکستران در محیط خارج سلولی دیده می شود. یک دنباله گذشت زمان از سه تصویر دو کانال (شکل 8 (b) از طریق 8 (d)) بینشی در مورد پویایی زمانی تعامل اکتین-وستیکول در طی فرآیند پینوسیتوز ارائه می دهد. یک مطالعه از این نوع می تواند به طور منطقی برای برچسب زدن تعدادی از پروتئین های سیناپسی با استفاده از انواع مختلف رنگ GFP به منظور بررسی تعامل و پویایی آنها گسترش یابد.

اگرچه نمونه های TIRFM در دو بعد تصویربرداری شده است ، مکانیسم هایی وجود دارد که با استفاده از آنها می توان اطلاعات سه بعدی در مورد محل وزیکول ها یا ساختارها در سلول ها را بدست آورد ، هم در مطالعات سلول زنده و چه در آماده سازی رنگ آمیزی ثابت. شکل 9 ساختار موجود در سلولها را نشان می دهد که از نظر ایمنی توبولین دارای برچسب ایمنی است و با استفاده از هر دو اپی فلوئورسانس گسترده (شکل 9 (a)) و روشنایی موج evanescent تصویربرداری می شود (شکل 9 (ب)). جزئیات ساختاری در تصویر TIRFM آشکار می شود که با اپی-آموخته معمولی قابل تجسم نیست. مقایسه دو حالت تصویر با روکش آنها در شبهکل تأکید می شود. در شکل 9 (c) ، اپی فلوئورسانس رنگ سبز اختصاص داده شده است ، در حالی که تصویر TIRFM به رنگ قرمز نشان داده شده است.

اصول TIRFM نشان می دهد که با تغییر زاویه بروز نورپردازی ، و در نتیجه عمق نفوذ موج فرسوده ، فلوروفورها را می توان با عمق در مقیاس نانومتری متمایز کرد. این تکنیک دقیق کنترل عمق نفوذ در سیستم های منشور به راحتی انجام می شود ، و پیشرفت فنی اخیر این روش استفاده از انحرافات آکوستیک نوری (AOD) برای تغییر سریع زاویه بروز است. با تغییر سریع در عمق میدان evanescent ، وزیکول های هدف یا سایر سازه ها را می توان در اعماق مختلف ردیابی کرد و موقعیت های آنها به طور دقیق تعیین می شود. تعدادی از کاربردهای بالقوه مفید AOD در TIRFM وجود دارد ، از جمله استفاده به عنوان کرکره های بسیار سریع که می توانند به سرعت طول موج روشنایی را در سیستم های مجهز به لیزر چند خطی تعدیل کنند.

شکل 8-دینامیک چند طیفی وزیکول-اکتین

همانطور که در بالا مورد بحث قرار گرفت ، تغییر زاویه بروز در سیستم های مبتنی بر هدف به آسانی در مورد کسانی که از منشور استفاده می کنند ، به راحتی انجام نمی شود ، اگرچه اهداف دیافراگم عددی بالاتر جدیدتر پیشرفت قابل توجهی در طیف وسیعی از تنظیم زاویه بروز ایجاد می کند. به طور کلی ، سیستم های نوع عینی قادر به تشخیص نور ساطع شده تر هستند و شدت این سیگنال با فاصله یکنواخت کاهش می یابد. این خاصیت در کالیبراسیون سیستم TIRFM یک مزیت است به طوری که سطح سیگنال فلورسانس می تواند مربوط به موقعیت محوری باشد و رویکرد دیگری به تصویربرداری سه بعدی ارائه می دهد.

چشم انداز توسعه آینده

تئوری اساسی TIRFM اکنون به خوبی تثبیت شده است ، و اجرای عملی این تکنیک با پیشرفت های اخیر فناوری بسیار تسهیل شده است. در نتیجه ، تعداد فزاینده ای از تحقیقات زیست شناسی بیومولکولی و سلولی با استفاده از این تکنیک انجام می شود. پیکربندی سیستم های TIRFM مبتنی بر میکروسکوپ های عمودی یا معکوس با استفاده از منبع نور لیزر نسبتاً ساده است و در صورت ایجاد اصلاحات برای جلوگیری از عبور نور از منطقه مرکزی هدف ، می توان با استفاده از منابع لامپ قوس معمولی انجام شد. سیستم های میکروسکوپ ماژولار کامل ، که برای TIRFM در رابطه با سایر تکنیک های نوری پیکربندی شده اند ، در حال حاضر در دسترس هستند ، و برخی از تولید کنندگان اهداف دیافراگم عددی بالایی را ارائه می دهند که به طور خاص برای برنامه های بازتاب داخلی طراحی شده اند ، مانند اهداف APO TIRF Nikon. تکنیک TIRFM با طیف گسترده ای از حالت های روشنایی ، از جمله Brightfield ، Darkfield ، کنتراست فاز و کنتراست تداخل دیفرانسیل و همچنین اپی فلورسانس معمولی سازگار است. یک مزیت خاص از سیستم های مبتنی بر هدف این است که می توان آنها را در رابطه با مکانیسم های مختلف برای دستکاری زیست مولکولهای مانند میکروسکوپ نیروی اتمی استفاده کرد. این احتمال وجود دارد که TIRFM همچنان با سایر تکنیک های مکمل ادغام شود.

دستیابی به داده های تصویر با وضوح زمانی بالا در سلولهای زنده در طول موج های مختلف ، منطقه ای از وعده های عالی برای TIRFM است ، و استفاده گسترده از ترکیبات مختلف رنگ ، مطمئناً پویایی سلولی را با جزئیات بیشتری از آنچه قبلاً ممکن بود نشان می دهد. به تازگی ، محققان از شناسایی طول موج انتشار دوگانه با استفاده از فلوروفورها که می توانند در طول موج واحد هیجان زده شوند ، گزارش کرده اند و امکان گسترش قابلیت های TIRFM با پیکربندی سیستم ها برای تحریک طول موج وجود دارد. مطالعات تک مولکول با توسعه بیشتر در خصوصیات رنگ و با ادامه بهبود ردیاب ها بسیار افزایش می یابد. گسترش رویکرد TIRFM در مطالعات سلولی احتمالاً از طریق پالایش تکنیک های دستکاری ژنتیکی و مولکولی ، همراه با تشخیص نوری در وضوح زمانی و مکانی بالا که توسط تحریک موج Evanescent فراهم می شود ، ادامه خواهد یافت.

شکل 9 - ساختار سلولی در روشنایی فلورسانس Widefield و TIR

از آنجا که TIRFM و میکروسکوپ کانفوکال اسکن لیزر (LSCM) دارای قابلیت های مشترک خاصی هستند ، این دو روش به طور طبیعی هنگام ارزیابی رویکردهای احتمالی برای مشکلات تحقیق مقایسه می شوند. اگرچه هر دو تکنیک قابلیت تقسیم نوری را فراهم می کنند ، رویکرد TIRFM محدود به مناطق نمونه ای است که دارای رابط شاخص انکسار مناسب هستند ، در حالی که میکروسکوپ کانفوکال می تواند به طور انتخابی تقریباً هر صفحه نمونه را تصویر کند. حداقل ضخامت بخش نوری تولید شده توسط روشهای کانفوکال ، با این حال ، تقریباً 600 نانومتر است - به طور قابل توجهی ضخیم تر از بخش های 100 نانومتر معمولی از تکنیک TIRFM. در بسیاری از برنامه ها ، مطلوب است که کل شار نورپردازی را در نمونه به حداقل برسانید (برای مثال کاهش آسیب سلولی) ، و از آنجا که ابزارهای کانفوکال یک حجم نمونه نسبتاً بزرگ را روشن می کنند ، این کار به راحتی با TIRFM انجام می شود. به طور کلی ، پیکربندی یک ابزار TIRFM ، که به سیستم های اسکن پیچیده احتیاج ندارد ، اقتصادی تر است و تقریباً می تواند در هر میکروسکوپ نوری در سطح تحقیقاتی مدرن ساخته شود. سیستم های کامل و آماده سازی که توسط تعدادی از تولید کنندگان ارائه می شود ، مستقیم ترین نقطه ورود به تکنیک TIRFM است و امکان ترکیبی از سایر حالت های قدرتمند تصویربرداری نوری را فراهم می کند.

نویسندگان مشارکت کننده

استفان تی. راس و استنلی شوارتز - گروه علوم زیستی ، Nikon Instrument ، Inc. ، 1300 Walt Whitman Road ، Melville ، New York 11747.

توماس جی فالرز و مایکل دبلیو دیویدسون - آزمایشگاه ملی میدان مغناطیسی بالا ، 1800 دکتر پل دیراک شرقی ، دانشگاه ایالتی فلوریدا ، تالاهاسی ، فلوریدا ، 32310.